Base nitrogenada

Azúcar

fosfato

ribosa

desoxi-ribosa

enlace
β-glucósido

nucleósido

nucleótido

Estructura de nucleósidos y nucleótidos

Estructura de
nucleósidos y nucleótidos

RNA

DNA

citosina

Purinas

Pirimidinas

Estructuras de bases nitrogenadas

Bases primarias (normales)

Bases secundarias

*Nucleósido y nucleótido son nombres genéricos que incluyen tanto las formas ribo- como las desoxirribo-

RNA

uridilato

uridina

Uracilo

RNA
DNA

Timidilato
desoxitimidilato

Timidina
desoxitimidina

Timina

RNA
DNA

Citidilato
desoxicitidilato

Citidina
desoxicitidina

Citosina

Pirimidinas

RNA
DNA

Guanilato
desoxiguanilato

Guanosina
desoxiguanosina

Guanina

RNA
DNA

Adenilato
desoxiadenilato

Adenosina
desoxiadenosina

Adenina

Purinas

Ácido nucleico

Nucleótido*

Nucleósido*

Base

RNA
DNA

Inosinato
desoxi-inosinato

inosina
desoxiguanosina

Hipoxantina

Nomenclatura de
nucleósidos y nucleótidos

Las bases tienen grupos ionizables

Adenina

adenina

guanina

guanina

citosina

citosina

timina

timina

pKa=3.8

pKa=2.4

pKa=9.4

pKa=9.5

pKa=4.5

N1

N7

N3

N3

Formas

tautómeras

El grupo fosfato es fuertemente ácido

Fosfatos totalmente ionizados a pH fisiológico (pKa=1.0)

Carga neta negativa

Repulsión entre cadenas dependiendo de I

Ionización afecta a la estabilidad de la doble hélice

N3

Propiedades ácido-base de los
ácidos nucleicos

P

3’

5’

P

3’

5’

P

3’

5’

P

3’

5’

P

P

OH

P

3’

5’

P

3’

5’

P

3’

5’

P

3’

5’

P

3’

5’

P

P

H2O

hidrólisis

Extremo 5’

Extremo 3’

polimerización

5’

3’

NTP + H2O	NMP+ Ppi

ΔG0= -31 kJ/mol

DNAn + NMP	DNAn+1 + H20

ΔG0= +25 kJ/mol

DNAn + NTP	DNAn+1 + PPi

ΔG0= -6 kJ/mol

Química de la polimerización

Enlace
fosfodiéster
3'-5'

P

3’

5’

P

3’

5’

P

3’

5’

OH

P

3’

5’

P

3’

5’

P

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

OH

A

T

G

C

T

G

A

T

G

C

T

G

pApTpGpCpTpG

( ApTpGpCpTpGp )

ATGCTG

5’

3’

5’

3’

Convenios de escritura de secuencias de nucleótidos

a)

b)

c)

d)

Siempre 5'→3'

Replicación

Transcripción

Traducción

Puentes de hidrógeno de Watson-Crick:

Autoreplicativa:

ATGCATGCATGC
TACGTACGTACG

ATGCATGCATGC
TACGTACGTA

ATGCATGCAT
TACGTACGTACG

5’

5’

3’

3’

5’

3’

5’

3’

Puentes de hidrógeno

Reglas de Chargaff:

[purinas] = [pirimidinas]
[A] = [T]
[G] = [C]

Complementariedad entre bases

5’

5’

3’

3’

5’

3’

antiparalela

dextrógira

Paso de hélice: 3.4 nm

Fosfatos exteriores
(cargados)

Bases interiores
(hidrófobas)

Surco mayor

Surco menor

2.4 nm

 Doble hélice


micelar

 Complementaria

 Energía:	- puentes de hidrógeno
- apilamiento de bases (π- π)
- interacción hidrófoba

DNA: modelo de Watson-Crick

N sin

N anti

1’

3’

4’

2’

5’

endo

giros

0.34 nm

Ascenso por par de bases

giro por
par de bases

B-DNA: estructura helicoidal

B-DNA: estructura de la hélice

Conformaciones de la ribosa
en el DNA

al fosfato

al fosfato

al fosfato

al fosfato

B-DNA

A-DNA

Desplaza el HO en C2'

Cambia ángulo de fosfatos

B-DNA

A-DNA

Z-DNA

H-DNA

2

dextrógira

2.37 nm

0.34 nm

36o

1o

3.4 nm

10

C2’ endo

anti

Ancho y profundo

Estrecho y profundo

DNA normal

Cadenas

Sentido

Diámetro

Elevación

Rotación

inclinación

Paso

Residuos

Ribosa

Base

S. Mayor

S. Menor

Condiciones

2

dextrógira

2.55 nm

0.25 nm

33o

19o

2.8 nm

11

C3’ endo

anti

Estrecho y profundo

Plano

DNA deshid. DNA/RNA
RNA/RNA

2

levógira

1.84 nm

0.37 nm

-30o

9o

4.56 nm

12

CT C2’, AG C3'

CT anti, AG sin

Plano

Estrecho y profundo

Alternando
Pur Pir (GCGC)

3

dextrógira

2.5 nm

---

---

---

---

---

---

---

---

---

2 Hebras Pir y 1 Pur

DNA: conformaciones en hélice

H-DNA: triples hélices dextrógiras

Hélice triple dextrógira

Apareamientos de Hoogsteen

Hebras asimétricas: sólo Pur / sólo Pir

Funciones:?

Relajamiento superhelicoidal

Recombinación

Hebra suelta

↓Lk

DNA dúplex

DNA dúplex

H-DNA

triplex

H-DNA: apareamientos de Hoogsteen

Apareamiento
Watson-Crick

Apareamiento
Watson-Crick

Hebra Pur

Hebra Pur

Hebra Pir

Hebra Pir

Hebra Pir'

Hebra Pir'

Apareamiento Hoogsteen

Apareamiento Hoogsteen

A través del grupos expuestos en el Surco Mayor

Variaciones locales y supersecundarias en la doble hélice

Las variaciones de conformación permiten interacción específica Proteína-Ác. nucleico

palíndromo
(secuencia repetida invertida )

Estructura cruciforme

Estructuras supersecundarias
secuencias autocomplementarias

GC

GC

AT

AT

Variaciones locales
diámetro

torsión

surcos

Dependientes de secuencia local

surco menor

surco mayor

Grupos superficiales y surcos en el DNA dúplex

Fosfatos:
interacciones electrostáticas inespecíficas

Surcos:
puentes de hidrógeno específicos

cremallera de leucina

Receptor de glucocorticoides humano

Dedos de Zn

Receptor de estrógenos humano

Dedos de Zn, factor zif268 de ratón

Reconocimiento de secuencias
de DNA específicas

Reconocimiento de secuencias sin desenrollar el dúplex

Proteínas que reconocen secuencias de DNA
(TATA-binding protein)

Superenrollamiento del DNA

Propiedad topológica

Sin rotura de enlaces covalentes

Invariable a deformaciones

Extremos fijos

DNA circular

Puntos de anclaje inmóviles

Topoisómeros de DNA circular

Densidad superenrollamiento, σ →

plectonémico

solenoidal

En solución

En la célula

(más compacto)

interconvertibles

Topología del superenrollamiento

Lk = Tw + Wr

W: superenrollamiento

T: giro de hélice

L: nº de cruces
del plano

Parámetro topológico

Nº entero

constante

Parámetros geométricos

variables (interconvertibles)

no enteros

Tensiones superhelicoidales

DNA relajado
L0 = 8

DNA tenso
Lk = 7

T = 8
W = 0

-1 vuelta

Tensión

ΔG >0

ΔLk = ΔTw + ΔWr

L ≠ T + W

T = 7
W = 0

T = 8
W = -1

ΔWr

Superenrollamiento

ΔTw

Fusión local

ΔLk=-1

Superenrollamiento requiere energía

30% 70%

Topoisomerasas: catálisis de cambios en Lk

Tipo 1: Corte monohebra

Tipo 2: Corte de doble hebra

ΔL = ±1

ΔL = -2

―P
|

Tyr

P―
|

Tyr

Intermediario covalente

Eucariotas: antitumorales
procariotas: antibióticos

(ác. Nalidíxico)

(novobiocina)

Relajación de tensiones superhelicoidales

Cambios conformacionales:

Mecanismos enzimáticos: Toposisomerasas

reclutamiento

activación

Desnaturalización del DNA: Estabilidad de la doble hélice

ΔG = ΔH -TΔS

Transición
hélice-ovillo
reversible

Término entálpico, ΔH:

Término entrópico, ΔS:

rotación de enlaces

liberación de agua (apilamiento)

Repulsión electrostática de Pi

Puentes de Hidrógeno intercatenarios

Interacción p por apilamiento de bases

Fuerza iónica, I

pH

urea,
formamida

calor,
(temperatura)

Factores que afectan a la estabilidad:

Temperatura

Fuerza iónica

pH

desestabilizantes de H (urea, formamida)

Desnaturalización del DNA:
efecto hipercrómico

nativo
(frio)

Desnaturalizado

(caliente)

250

200

300

Longitud de onda, nm

Absorbancia

1.5

1.0

0.5

El DNA absorbe luz UV (260 nm)

1.5

1.0

0.5

A260

Efecto hipercrómico:
Aumento de absorbancia a 260 nm

Desapilamiento de bases

Desnaturalización térmica del DNA

Tm: temperatura
de fusión

El DNA se funde al calentar

Rehibrida la enfriar

Transición fuertemente cooperativa

Tm= T0 + k·log(I) + α·(%GC) + β·(%F)

Tm aumenta con %(G+C)

(y también en ácido)

El DNA se desnaturaliza en medio fuertemente básico (o ácido)

La ionización de las bases afecta a los
puentes de hidrógeno de Watson-Crick

DNA genómico y tamaño del genoma

virus

hongos

aves

103 104 105 106 107 108 109 1010 1011 1012

DNA genómico (pb por genoma haploide)

haba

E. coli

levadura

tiburón

Drosophila

Xenopus

Hombre
4·109 pb

Procariotas

Eucariotas

Peces cartilaginosos

bacterias

plantas

insectos

moluscos

Peces óseos

reptiles

mamíferos

anfibios

DNA genómico: tamaño del DNA total

sin correlación

DNA no codificante

C. elegans

19.000

H. sapiens

35.000

Genoma: conjunto de genes del organismo

≈ evolución?

Estructura molecular del gen

promotor

pontenciadores

intrones

exones

adenilación

Señales de
control 5'

Señales de
control 3'

Región codificante

Gen: secuencia completa de DNA necesaria para dirigir la síntesis de un polipéptido funcional

5'

3'

No funcional

Señales de control:

puntuación: inicio y fin de transtripción/traducción

regulación de la expresión

5', 3' y en intrones

DNA codificante:

exones (minoritario)

DNA no codificante:

señales de control

intrones

DNA no funcional (“basura”)

Unidades de transcripción

Procariotas: mRNA policistrónicos

Eucariotas: mRNA monocistrónicos

proteínas

proteínas

Un sólo mRNA codifica varias proteínas

Transcripción simultánea

regulación coordinada

Genes agrupados

Genes independientes

mRNA individuales

Transcipción y regulación independiente

Red de señales de control

U. de transcripción eucariotas: procesamiento del mRNA

Simples: un sólo polipéptido

Complejas: varios polipéptidos del mismo gen

Eliminación de intrones (splicing)

Modularidad

Reutilización

Splicing alternativo

Variación exón 3'

Variación exón interno

Variabilidad

Especificidad

Adaptabilidad

telómero

telómero

centromero

Repeticiones de secuencias TEL

Repeticiones de secuencias CEN

Otras repeticiones

DNA satélite repetitivo

Organización génica en
procariotas y eucariotas

Cromosoma lineal

Cromosoma circular

Codificante de proteínas

Genes de copia única

Genes duplicados

Genes repetidos en tándem

Histonas

genes RNA

DNA repetitivo

DNA de secuencia simple

DNA moderadamente repetido

Transposones

Retrotransposones virales

Elementos dispersos largos (LINES)

Elementos dispersos cortos (SINES)

DNA espaciador

100 copias tándem,
≈ 100kb

DNA satélite

Minisatélite
20-50 copias
1-5 kb

25-40%

15%
L1 6 kb, 0.6·106 copias

Alu 300 pb
106 copias
10%

Sin secuencia o
función definida

Retrotransposones no virales

DNA
móvil

Tipos de DNA eucariótico

5%

50-55%

1% ?

10-15%

Organización del DNA codificante

2

Lisozima

15 kB

4,66

6,12

no mRNA

no mRNA

60 kB

Secuencias Alu

Genes simples: Lisozima de pollo

Familias génicas (clusters): β-globina

ψβ2

ψβ1

β

δ

ε

Gγ

Aγ

codificante

pseudogenes

(no funcional)

Secuencias Alu

Repeticiones en tándem: histonas y RNAs

5,28

5,28

5,28

RNA 18S

H1

H3 H4

H2A

H2B

H1

H3 H4

H2A

H2B

H1

H3 H4

H2A

H2B

6 kB

2,73

13 kB

RNA 6S

RNA 28S

rRNA,	n>100

tRNA,	n=10 -100

n = 30 - 30

en ambos sentidos
(hebras)

DNA empaquetado: cromatina

I normal

(0.15 M KCl)

I baja

Fibras de cromatina
(30 nm)

Cuentas en rosario
(10 nm)

Fibra de DNA

9,91

5,96

11 nm

5.5 nm

Núcleo de histonas

octámero

DNA ligado

≈ 146 pb

compacto, estable

DNA de conexión

≈ 15-55 pb

sensible a nucleasa

Nucleosoma

Histona H1

mantiene el DNA conector

Estructura del nucleosoma

Histonas:

básicas (R,K)

muy conservadas

regulables

DNA unido:

Int. Electróstáticas

(surco menor)

superenrollamiento negativo

(ΔL=-1/nucleosoma)

Solenoide levógiro 1.7 vueltas

Acetilación

metilación

fosforilación

Unión a secuencias ricas en AT

“pinzas” para atrapar DNA

octámero

Tetrámero + Tetrámero

2 H3

2 H4

2 H2A

2 H2B

30 nm

Fibra de cromatina de 30 nm

enrollamiento solenoidal

Histona H1

Brazo de unión
15-55 pb

Estructura de las fibras de cromatina

Compactación DNA: x100

Diámetro de la cromátida 700 nm

300 nm

andamiaje

cromatina 30 nm

Topo II
H1

Estructura de los cromosomas

DNA:

1 única molécula lineal

Proteínas:

Histonas

P. andamiaje (scaffold)

HMG (heterogéneas

Andamiaje del cromosoma

1-3·108 pb
≈ 10 cm

8·109 pb /
46 cromosomas
≈ 2.72 m

Secuencias específicas
de unión(MARs, SARs)

Unión cromatina-andamiaje: Bucles funcionales

Empaquetamiento del andamiaje

Superenrollamiento helicoidal

Estructura de los elementos funcionales básicos del cromosoma

Secuencias ARS:

Centrómeros:

Telómeros:

telómero

telómero

centromero

ARS

Múltiples
(1/3-300 kpb)

Ricas en AT

(fácil fusión)

levadura

Drosophila

mamíferos

Inicio de replicación

Unión al uso mitótico

segregación mitótica

Altamente repetido en tándem
DNA satélite

5' TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG 3'
3' AATCCC AATCCC AATCCC AATCCC 5'

Prevenir degradación

anclaje de reparadores

Hebra rica en TG

Extensión 3'
≈1 kpb

Hebra rica en AC

10,53

Repeticiones teloméricas
1-50 kpb

Telómeros de mamíferos

TRF1

TRF2

PARP

TIN2

Protección de la degradación

anclaje de reparadores

Visualización molecular de bucles-T

NTP + H2O	NMP+ PPi

ΔG0= -31 kJ/mol

DNAn + NMP	DNAn+1 + H20

ΔG0= +25 kJ/mol

DNAn + NTP	DNAn+1 + PPi

ΔG0= -6 kJ/mol

Polimerización de DNA: características generales

Hebra molde

Hebra cebadora

3' OH

apareamiento estable

5'

3'

Liberación de PPi

dNTPs sustrato

Cebador 3'OH

Direccional: 5'→3'

Dependiente de molde

Alta procesividad

Alta fidelidad

Maquinaria de la replicación

DNA polimerasas:
fidelidad de copia

fidelidad=diferencia energética

pol=10-7

Apareamiento de Watson-Crick

mal-apareamiento

ΔΔG≈4-15 kJ/mol

pol=10-7

DNA pol I de E. Coli

Bien apareado

mal apareado

Fusión local

4-5 pb

molde

Unión surco mayor

Sitio 3' exo

Sitio pol

Inserción específica

extensión selectiva

3' exonucleasa

≈ 1:10 correctos

Fidelidad x 103-104

Múltiples orígenes
1/ 3-300 kpb

ATP

RPA

RFC

duplex

5’

3’

DNA pol α

3’

5’

3’

Intercambio de polimerasa

ATP
+

PCNA

DNA pol δ / ε

Unión a frontera
cebador dúplex –
monohebra

Unión de alta afinidad a
DNA-RPA

Salida de primasa
DNA pol α

Ensamblaje de la arandela de procesividad

Polimerasa replicativa

Hebra conductora: >10 kb
Hebra retrasada: 0.2-0.5 kb

Arandelas de procesividad

DNA pol III β

PCNA

trímero p36

H2O

p41

p41

3.5 nm

DNA

ADP +Pi

ATP

ATP

ATP

RPA

RFC

PCNA

duplex

monohebra

5’

3’

Carga de la arandela
ATP-dependiente

┴ a surcos

p21CIP1

ATP

Ensamblaje por actividad

ATPasa de RFC

Replicación y topología del DNA

Superenrollamientos positivos
delante de la horquilla replicativa

aliviados por tipoisomerasas

Empaquetado del DNA naciente
detrás de la horquilla replicativa

Inhibidores Topo bloquean replicación

Topo I humana: camptotecina
(antitumoral)

DNAgirasa bacteriana:

Ác. Nalidíxico (sub A)

novobiocina (sub B, ATPasa)

Topo I

Topo II

Helicasa DnaB

primasa RNA pol

SSB

avance de la horquilla

Duplex parental

arandela β

arandela β

avance de
hebra conductora

avance de
hebra retrasada

cebador

primer

hebra conductora

hebra rezagada

núcleo pol III

núcleo pol III

DNA ligasa I

DNA pol I

complejo γ

DNA pol α
3’ exo ε
θ

γ
δ
δ’
χ
ψ

Cargador de β

Máquina de Replicación de Procariotas

Helicasa DnaB 5’---3’: hebra retrasada

Primosoma permanente

Cebador RNA

Sin cambio de polimerasa

Ensamblado en máquina molecular dimérica (subunidad τ)

Fragmentos de Okazaki largos

Maduración por DNA pol I

DNA pol 5’---3’
exonucleasa 3’  5’ corrección)
exonucleasa 5’  3’ (Okazaki)

Mecanismos de daño al DNA

Mecanismos de Reparación del DNA

Nucleótido difosfohidrolasas

Mantenimiento y control de calidad

MMR Rep. Malapareamientos

dependiente de metilación

postreplicativo

BER Rep. por escisión de base

DNA-N-glucosilasas/PARP

NER Rep. Por escisión de nucleótidos

excinucleasas

Rep. por unión de extremos no homólogos (NHEJR)

Ku/DNA-PK/PARP

Reparación directa

fotorreactivación:	DNA fotoliasa

desalquilación:	O6-alquil-guanina transferasa

Mecanismos no específicos

Rep. Translesión

DNA pol ζ, η, ι

Rep. por recombinación

Intermedios de Holliday, proteínas Rec

preventivo

Sistemas de detección de daños especializados

Fallos replicativos

Uracil-DNA

bases alteradas

sitios AP

malapareamientos

Defectos estéricos

dímeros de timina

aductos de base

Mod. voluminosas

Roturas de doble hebra

Bloqueos de polimerasa

Roturas de doble hebra

entrecruzamientos

Bloqueos de polimerasa

Sin sistema de detección dedicado

Reparación del DNA

irreversible

Transparencias DNA

Enrique Castro

2002-11-09T19:07:49

Enrique Castro